异构卡马西平代谢物的液相色谱分离和高分辨率精确的质量

关于废水中排泄药物存在的环境问题有很好的记录，[1]和高分辨率质谱(HRMS)的引入，如飞行时间和Orbitrap仪器，有助于检测它们。虽然HRMS是一种高度特定的技术，但在复杂矩阵中可能会发生干扰。本文描述了使用Thermo Scientific Orbitrap Q Exactive HRMS仪器[2]分析卡马西平(CBZ)及其代谢物废水样品时遇到的一些问题是如何克服的

卡马西平是一个广泛的处方药物用来治疗癫痫和神经性疼痛,它是一个持续的环境污染物在污水处理不分解。
大多数药物在排泄之前就被代谢掉了，但是在废水中检测这些代谢物才刚刚开始常规测试。CBZ主要以反式-10,11-二氢-10,11-二羟基卡马西平(trans-CBZdiOH)代谢物的形式排泄，但也形成环氧化物代谢物，环氧卡马西平(CBZEP)，它对人体[3]产生负面副作用，在环境中是有毒的。还有5种CBZ的单羟基代谢产物具有与CBZEP相同的前体离子确切质量，并且由于它们都在结构上相似，在破碎时产生相同的最高丰度的产物离子。奥卡西平(OxCBZ)是CBZ的替代品，因为它不代谢为有毒的CBZEP，但它也与CBZEP和单羟基代谢物具有相同的分子式。这使得即使使用HRMS也很难区分不同的代谢物，需要仔细解释数据和良好的色谱，以确保单羟基代谢物从CBZEP中分离出来，并且不会报告虚假的高浓度。另一种新的替代CBZ的药物是eslicarbazepine (EsliCBZ)，它也包括在本研究中。
本研究分析物的化学结构、前体离子及分子式总结如表1所示。
表1。本研究的化学结构和前体离子。
用于分析的质谱仪为Thermo Scientific Q-Exactive Orbitrap质谱仪，配有Dionex Ultimate 3000 RS泵、Dionex Ultimate 3000 RS自动进样器(温度控制在10ºC)和Dionex Ultimate 3000 RS柱室(温度控制在30ºC)。
软件为Chromeleon®、Xcalibur™和Tracefinder™。
以3.5千伏的电喷雾正电离模式进行电离。护套和辅助气体分别为45和10个任意单位，毛细管和辅助温度均为300℃。全MS-SIM实验范围为50 ~ 750 m/z，目标离子采用MS2靶向方法，隔离窗口为4 m/z。两个实验的质量分辨率都是35000。
色谱柱为Waters Atlantis®dC18色谱柱150 × 2.1 mm，粒径3µm。
流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸在超纯水中。LC梯度从99% B开始，持续2分钟，然后在3分钟内达到70% B，并保持11分钟。B的组成在1分钟内降至1%，并维持3分钟。最终在1分钟内恢复到99% B，并在9分钟内重新平衡。流速为0.2 mL/min，进样量为10 μL。
首先分别注入含有CBZ、cis-CBZdiOH、trans-CBZdiOH、CBZEP、OxCBZ、EsliCBZ和CBZ- 10hydroxydihydro浓度为1000 ng/mL的溶液，以确定每种分析物的保留时间。然后将它们作为混合物注入。
在处理过程中，在CBZ的237.11→194.0963的特定转变处观察到三个峰(图1A)。这是一种合成混合物，溶液中不应该含有任何具有这种特定过渡或前体离子的其他药物，特异性的丧失最初是令人担忧的。在7.9分钟对应EsliCBZ干扰，在12.5分钟对应10,11-二氢-10-羟基卡马西平干扰，跃迁分别为297.12→194.0963和255.11→194.0963。虽然它们具有相同的生成物离子，但前驱体离子却各不相同。
在9.5分钟时，CBZEP也观察到类似的污染，这次干扰的保留时间为6.4分钟和7.2分钟，这与顺式和反式cbzdioh一致。

更仔细的观察表明，这可能是由于离子源的碎片。虽然电喷雾是一种软电离技术，但一些分析物可以在离子源中分解。
进行了实验，以确认额外的峰是由于源内碎片。将EsliCBZ溶液以10 μ L/min的流速直接注入离子源。
将EsliCBZ溶液注入离子源(图2A)，产生了预期的EsliCBZ前驱体离子m/z 297.1227，钠加合物m/z 319.1045，源内击穿产物m/z 237.1017与CBZ一致。在层析过程中，EsliCBZ从柱中洗脱，进入离子源后部分分解为CBZ。这意味着在EsliCBZ的保留时间有两个前体离子存在，在m/z 297.1227处的EsliCBZ和在m/z 237.1017处的分解离子。这两种离子都会通过质谱仪，并在碰撞池中产生各自的产物离子。
当反式cbzdioh注入离子源时，也观察到类似的分解。
将trans-CBZdiOH溶液注入离子源(图2B)，产生了预期的trans-CBZdiOH前体离子m/z 271.1075和与CBZEP和cbz单羟基一致的击穿离子m/z 253.0969。输注实验是在正常离子源条件下进行的，离子源中没有施加碎片能量。
这两个输注实验证明了在离子源中可以发生一些转换。在发生转化的地方，分析物被保留时间很好地分开。然而，单羟基代谢物尚未进行测试，这增加了分析CBZ及其代谢物的复杂性。因此，需要可靠的色谱和前驱体和产物离子数据的仔细解释，以确保选择正确的分析物并准确测量。
由于缺乏单羟基标准，废水样品被用来确定所有代谢物的保留时间。该仪器出色的灵敏度和分辨率有助于将样品直接注入液相色谱质谱系统，只需在分析前对样品进行过滤，这仅限于少数样品。这将确保没有错过由于复苏差分析物在样品清理或浓度的一步。

采用所开发的LC法对废水样品进行了分析，部分样品的过渡峰为m/z 253.10→210.0921。253.10的3个主要产物离子分别为m/z 180.0814、182.0971和210.0921。根据CBZEP标准，在m/z 254.0812处观察到另一个产物离子。图3B表明，m/z 253.10→210.0921的转变不那么特异性，特别是对于CBZEP，但它是单羟基代谢物的首选离子。在反式cbzdioh之前(7.6分钟)洗脱的峰被认为是葡萄糖醛酸盐代谢物。经过仔细选择，确定了环氧化物的一个更具体的跃迁(m/z 253.10→182.0971)，从而进一步将其与干扰相区别开来。采用改进的色谱法和特异转变为CBZEP的定量提供了较好的方法。未知' A '具有前体离子m/z 255.1133，并不是10,11-二氢-10-羟基卡马西平，因为两者的保留时间不同。tMS2实验的隔离窗口更改为2 m/z，从而消除了这种干扰。
从CBZEP标准来看，转变253.10→182.0971和253.10→254.0812是CBZEP特有的，使用这些产物离子CBZEP从其他分析物中分离出来(图3 C和E)。m/z 254.0812的产物离子不同寻常，因为它比前体离子具有更高的分子量。准确的质量符合C15H12NO3+的分子式。这可以通过环氧环开口形成二羟基和NH2的损失来解释(图4B)。
图4。对比实验和理论模式CBZEP产品离子(253.10→254.0809)和提取离子色谱的13 c同位素CBZEP
= 254.1002。

有必要确认产物离子(m/z 254.0812)不是CBZEP的13C同位素。CBZEP的理论13C同位素见插图(图4C)。将CBZEP的实验离子与理论同位素图进行比较，证实其为CBZEP (m/z 254.0810)的产物离子，而不是13C同位素(m/z 254.1005)。使用分辨率较低的仪器，不能使用CBZEP的产物离子(m/z 254.0821)，因为不可能将其与13C同位素(m/z 254.1015)区分开来。
HRMS是非常敏感和选择性的，然而，稳健色谱仍然是复杂混合物必不可少的，仍然需要小心解释HRMS数据，以防止干扰和假阳性。

确认

本研究中使用的LCMS/MS系统由noPILLS项目资助，该项目是欧盟跨国领土合作计划INTERREG IVB NWE资助的一部分;这种支持得到了极大的承认。这项工作也由Phos4You项目通过INTERREG VB西北欧洲项目(2014-2020)在NWE292赠款下部分资助。我还要感谢我的博士生导师Moyra McNaughtan博士和John MacLachlan博士。

参考文献

1.嗅探器,2010年。沉积物和污泥中选定药物和滥用药物的分析方法，可在http://www.sniffer.org.uk/files/9113/4183/7992/ER09_Final_e-version_FINAL_3May101.pdf上获得。
2.罗伯茨，j.b.， 2017。用LCMS/MS法测定废水中药物和化学代谢物。博士论文，格拉斯哥加里多尼亚大学。
https://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.726806
3.苗族,X.-S。梅特卡夫博士，2003年。液相色谱-电喷雾串联质谱法测定水溶液中卡马西平及其代谢物。化学工程学报，37 (4)，pp. 366 - 366。可以在:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14572037。
4.巴赫曼，A.，布拉克，W.，施耐德，R.J.和克劳斯，M.， 2014。卡马西平及其代谢产物在废水:分析陷阱和发生在德国和葡萄牙。水资源研究，57，第101 - 114页