氨基酸分析使用安德鲁+自动制备

本应用说明的目的是演示手动制备AccQ●标签氨基酸与使用Andrew+液体处理机器人制备氨基酸标准试剂盒的氨基酸的等效性和鲁棒性。

简介

氨基酸是构成蛋白质的最基本成分，因此是细胞培养基和食物的基本成分。监测和优化生物反应器培养基中的氨基酸成分对确保细胞的最佳生长条件至关重要。同样，有必要确认食品符合规定的要求。因此，氨基酸的分析是一个重要的常规过程。
样品的制备和分析是一个耗时的过程，可能占据分析人员在实验室的大部分时间。自动化实验室准备系统提供了灵活性，为分析人员腾出时间进行其他任务，从而实现了更有效的时间管理方式。沃特斯已经为Andrew Alliance Andrew+平台创建了自动样品制备协议，与AccQ●标签超衍生化自动化套件(图1)和氨基酸标准套件一起。由于自动化系统的死容积要求增加，AccQ●标签超衍生化试剂盒可自动放大所需试剂的体积。所提供的试剂体积允许制备多达96个3 x 32样品格式的样品。
图1。AccQ●标签超衍生化自动化套件。
有含有21种氨基酸的食品和饲料试剂盒和含有26种氨基酸的氨基酸细胞培养标准试剂盒(表1)。Andrew+液体处理机器人的协议存储在OneLab中，这是一个基于云的软件，具有直观的用户友好的图形界面。本应用说明中使用细胞培养和食品和饲料氨基酸标准来演示手工和自动样品制备的结果。

实验

工作流程包括手动或自动的样品制备，然后在Empower Software中进行LC分析和数据处理。

分析方法的条件

表2。AccQ细胞培养/食品和饲料的标签分析方法。

设计的因素

协议的特点
基于AccQ●Tag衍生化自动化套件，为Andrew+液体处理机器人创建了一套三种样品制备协议(32、64和96个样品)。此外，校准线和试剂制备协议可在OneLab中获得，这是一种用于连接设备的协议设计和执行软件。校准线协议提供了500 μM至0.5 μM(胱氨酸250 μM至0.25 μM)标准稀释参考范围的能力。然后，得到的稀释标准可以与样品制备协议一起作为7点校准线使用。
试剂制备协议可与移液管+连接的电子移液管结合使用，为样品制备和衍生化协议制备试剂和标准。在制备样品时，也可以灵活地包括诺缬氨酸内部标准。
实验室的器具
用AccQ●标签衍生化试剂盒手工制备氨基酸样品，使用Waters总回收瓶进行。为了使这种自动化兼容，总回收玻璃小瓶被96孔Lo Bind PCR板取代。该实验室器皿也适用于在制备过程中与激振器+，Peltier+和夹持器设备一起使用。进行了测试以支持实验室软件的更改，没有检测到对产品性能的影响。

实验设计

对食品、饲料和细胞培养标准制剂进行了手工和Andrew+样品制备。AccQ●Tag Ultra衍生化自动化套件与至少两种不同的柱批和AccQ●Tag Ultra流动相洗脱液一起使用。在浓度范围(10 μM、200 μM和400 μM)的水平上创建三种溶剂面板(0.1 M HCl)，用于食物、饲料和细胞培养。这些面板包含了用于评估制备性能的相关氨基酸。

结果与讨论

评估了使用Andrew+平台的自动制备方法，并与手工制备方法进行了鲁棒性和等效性的比较。通过三个浓度水平(10 μM、200 μM和400 μM)监测性能特征，以确定准确性和精密度(保留时间、分析物峰面积和浓度)以及这些结果的线性。共有18个样本使用AccQ●Tag Ultra 32样本协议评估，每个水平有6个制剂。面板制作成一份，注射一份。在计算结果时使用了第一次注入。重复注射只在仪器出现问题时作为备份进行分析。所有实验均采用诺缬氨酸内标。诺瓦林内标的使用最好地补偿了样品水解和氨基酸分析中产生的可变性。
图3。分离10 pml的细胞培养标准，柱上加23.5 pml的Nva。
图4。分离10pml的食品和饲料标准，柱上加23.5 pml的Nva。

精度

为了证明自动样品制备相对于手工制备的重复性，确定了每个浓度水平的%CV。细胞培养Andrew+和人工制备的所有氨基酸和所有浓度水平的最大平均CV分别为2.0%和2.3%。在所有氨基酸和所有浓度水平上，食物和饲料Andrew+的最大平均CV为1.7%，手工为2.8%。表3和表4中的数据表明Andrew+和手工制备之间具有相当的精度。
表3。细胞培养%CV Andrew+和人工制备跨越10 μM, 200 μM和400 μM溶剂面板。
*由于集成错误，使用了第二次注入。
表4。Andrew+的食物和饲料%CV和人工制备跨越10 μM, 200 μM，
400 μM溶剂板。

精度

在浓度为10 μM、200 μM和400 μM时，使用每种浓度水平的6种制剂进行准确性评估。用六种制剂的平均浓度来计算与目标值的差值，以求得回收率。细胞培养、食物和饲料中每种氨基酸的回收率都在目标浓度的10%以内(表5和表6)。该回收率数据证明了Andrew+作为手动提取氨基酸的一种非常节省时间的替代品的适用性。
表5所示。细胞培养氨基酸标准%从目标值回收率。
表6所示。食品和饲料氨基酸标准从目标值的回收率%。

线性

使用细胞培养标准在0.5 μM - 500 μM(胱氨酸0.25 μM - 250 μM)范围内为每种氨基酸制备7个浓度水平的细胞培养标准来评估线性性。所有的分析运行均符合r2 > 0.995的标准，校准器2-7 (2.5 μM - 500 μM)和校准器1 (0.5 μM)的点偏差均不超过预期浓度的15%和20%。人工和自动制备方法的数据是一致的，没有观察到趋势。

表7所示。用Waters氨基酸细胞培养标准生成的细胞系的R2值。所有线路均通过R2值大于0.995的验收标准。
表8所示。用水氨基酸食品和饲料标准生成的线的R2值。所有线路均通过R2值大于0.995的验收标准。

结论

使用精密度、准确度和线性的性能特征来确定Andrew+制剂与手工制剂的等价性。结果表明UPLC氨基酸分析溶液的两种样品制备方法之间具有极好的可比性，但在进行比较分析时，也必须考虑自动化的便利好处:
Andrew+机器人提供了效率，但不影响精度和精确度，校准线制备和样品制备在一个小时内完成。
•开发的自动化协议在运行过程中不需要人工干预，利用蓝牙配置移液管等功能，在卷和夹持器设备之间切换，以传输实验室设备，从而允许分析师有时间执行其他实验室任务。
•OneLab基于云的软件允许用户从任何连接互联网的电脑或平板电脑上监控运行。
•自动化的使用消除了分析师与分析师之间的差异，允许实验室和公司标准化分析方法，并促进方法在多个站点之间的转移。

确认

Danielle Cullen, Niamh Stafford, Leanne Davey, Norma Breen (Waters Technologies)
爱尔兰有限公司);Steven Calciano，张宁(Waters公司，米尔福德，马萨诸塞州)。

主打产品

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