自动样品制备:Hypernation的缺失连字符

1980年Hirschfeld[1]首次创造了术语“联用”，用来表示色谱分离和一种或多种光谱/光谱检测技术的在线结合。为了充分利用两者的优势，分析界不断需要突破选择性和敏感性的边界，以应对不断增加的挑战和要求的分析应用，这推动了这次联姻。
近40年过去了，连字符分析技术现在是解决复杂定性和定量分析问题的首选方法。

为什么会这样呢?
对连字符的偏好可以归结为这种方法可以为分析师提供的三个关键优势:
•方便:克服了样品分选的需要，减少了仪器和操作时间
•控制:检测可根据色谱分离进行定制，例如使用分离器板(GC)或分流阀(LC)
•一致性:与人工处理相比，全自动在线样品注入和样品导入提供了更好的性能
随着气相色谱-质谱联用技术和lc -质谱联用技术的成熟，现在特别关注的是多重联用(也称为超民族)是整个设置的一个组成部分的系统，如Wilson和Brinkman在2003[2]中所讨论的。正是在超民族的视角下，样品制备的在线自动化找到了它的完美范围，作为一个附加的但极其宝贵的连字符。事实上，样品制备是任何分析工作流程中必不可少的一部分，尽管最新可用的连字符技术具有优异的性能，但复杂矩阵的高质量数据只能在依赖稳健和可重复的样品制备时才能获得。
用连字符连接的“自动样品制备”的附加价值是完全相同的，这促使我们首先选择用连字符连接:方便、控制和一致性。

为什么自动样品制备方便?

让我们以衍生化和GC-MS分析为例，用于非靶向代谢组学。代谢组学研究特定样本的代谢物组成，这种代谢图谱可以通过两种主要方法进行:靶向和非靶向。靶向代谢组学专注于预先设定的代谢产物集合的量化，而非靶向代谢组学提供了全局代谢指纹。在GC-MS代谢组学中，MOX-TMS是最常用的衍生化方法。这是一个两步走的衍生过程。初步的甲氧基化步骤(MOX)允许羰基反应生成肟。这一步对于防止还原糖的环化、酮-烯醇互变异构体的形成和脱羧等过程至关重要，并最终降低了由于每个代谢物存在多个峰而导致的色谱图的复杂性。连续的硅酰化反应(TMS)用烷基硅基取代感兴趣分子中的活性氢。硅基化不仅有助于改善分析物的GC色谱特性，而且还能增强质谱特性，为结构阐明提供诊断碎片模式。标准的工作流程需要2小时的样品准备以及40分钟到1小时之间的GC运行时间。 Noteworthy, TMS derivatives are sensitive to moisture, and they tend to degrade overtime, so it is quite crucial to run the samples freshly derivatised. When using automated sample preparation, it is possible to multitask. Sample preparation for each sample is performed immediately preceding the GC-MS injection whilst the previous sample is running. Figure 1 shows the timeline for the preparation and analysis of 10 samples when using hyphenated and automated sample preparation.
多色带表示样品制备过程，浅橙色带表示GC运行时。自动化的样品制备不仅提供了一个非常方便的选择，显著地消除了操作员的停机时间，而且还确保了新衍生的样品被及时分析，降低了降解的风险。
图1。当使用连字符和自动样品制备时，制备和分析10个样品的时间表。
为了支持一个客户的拨款申请，我们采用了一种非目标方法的全自动研究真菌内生菌的代谢多样性。3种内生真菌的6个重复(3、11和21)加上3个程序空白，共21个样品。使用几种统计工具对反卷积数据进行处理，以确定这三种真菌的关键标记。图2显示了得到的主成分分析图，这是一种有效的可视化方法，可以探索数据集中的方差并支持模式识别。这三种真菌和程序空白在不同的紧密簇中分离得很好。
图2。得到主成分分析图。

为什么自动样品制备是受控的?

SmartSPE®是受控自动样品制备能力的一个典型例子。事实上，手动SPE的主要限制之一是缺乏流量控制(即著名的“掉落规则”)。这种流量可变性往往转化为绝对采收率可变性。相反，在线SPE的自动化使用ITSP(仪器顶部样品制备)一次性使用小型化墨盒允许非常精确的流量控制(下降到0.1 μ L/s)，这获得了手动方法无法达到的色谱性能。小型化的墨盒装有定制的吸附剂，以匹配标准尺寸SPE墨盒中的材料。它们以96孔的形式出现，由机器人平台通过注射器针头进行处理。在SmartSPE®中，流量分布遵循预期的Van Deemter曲线，并明确定义优化[3]，如图3所示。
图3。SmartSPE流量曲线遵循预期的Van Deemter曲线，具有明确的优化定义。
作为精确的流量控制的结果，>的绝对回收率可达到99%，同时背景矩阵显著减少。当使用离子交换固相萃取时，流量控制的重要性更加关键。事实上，根据Hayward所做的流量优化研究，最佳流量的范围要窄得多，如果不能达到最佳流量，采收率可能会急剧下降。智能gc - ms控制自动化应用于血液中四种法医相关的阿片类药物的测定。阿片类包括天然和半合成生物碱。它们存在于罂粟植物中，用于治疗急性疼痛。不幸的是，它们极易上瘾，因此在全球被视为滥用毒品。手动工作流程包括最初的蛋白质碰撞，阳离子交换SPE以丰富分析物浓度，减少基质干扰，然后蒸发和硅酰化，然后进行GC-MS分析。在本研究中，使用SmartSPE®制备和提取加盐血液样本，然后直接注入GC-MS。样品批次包括有内部标准的空白和5个校准器，分别在3天内制备，以评估稳健性和再现性。 Linearity was excellent and error bars showed particularly good inter days variability. Recoveries were above 90% and signal to noise at the lowest calibration point was above 10 for all analytes except for 6-MAM.

为什么自动样品制备是一致的?

一致性是使用数据分析来驱动方法开发和数据挖掘的分析方法的关键需求。因此，自动化与许多有价值的数据分析工具提供了强大的协同作用。实验设计(DoE)是一种确定影响过程的因素与该过程的输出之间关系的系统方法。一旦建立了因素和过程之间的关系，这些信息就可以用来优化响应。必须弄清楚对这些因素的一致控制对于将分析变异性减少到最小是多么重要。事实上，高的分析变异性会掩盖实验空间调查所产生的信息。这个例子描述了使用自动化来执行实验设计。利用DoE优化了脂肪酸衍生为吡啶酰基衍生物的过程。衍生化通常涉及到几个参数的优化，以实现最佳性能，因此它们为DoE提供了一个非常好的环境。传统上，脂肪酸是用其甲酯衍生物(FAMEs)进行GC-MS分析的。 However, FAMES mass spectra cannot provide ions indicative of structural features such as double bonds and branch–points. On the other hand, fatty acids picolinyl esters are a better option for structural elucidation. In these derivatives, it’s a nitrogen atom to carry the charge rather than the alkyl chain and this aspect minimises double bonds ionisation and migration, helping to provide very informative structural information. To perform the DoE, four factors were chosen together with their respective range and picolinyl derivatives peak area were chosen as responses. DoE generates a matrix of experiments where trials are run at all possible combinations of all factors settings. The response is recorded for each of the experiments. Using of hyphenated and automated sample preparation makes the experimental side of any DoE conveniently and consistently delivered. As a standard DoE approach, firstly scoping trials were performed to estimate the experimental random variation and evaluate the experimental design space. The scoping trials usually comprise a minimum of four trials: low, where all variables are set at the lowest level, centre points where all variables are set in the middle of the experimental range and high where all variables are set at the highest level. Centre points allow to evaluate for non-linearity and random variation. The pilot trials confirmed significant variability in the experimental space worthwhile to further investigate. Secondly, screening designs were used to differentiate significant factors and find existing interactions between factors. Statistical tools helped with the interpretation of the results. The screening design highlighted a significant effect of temperature suggesting quadratic behaviour. To confirm the trend, an optimisation step was conducted to finalise the relationship between the different factors and the response. Once the optimal conditions were confirmed, the process was run in these conditions in replicates to assess robustness and variability. Figure 4 shows the results for repeatability and reproducibility obtained for a fatty acid mixture C4 to C22.
图4。结果的重复性和再现性得到的脂肪酸混合物C4到C22
在烷基链的范围内可以观察到一定的变化，但这是可以理解的，因为选择的最佳条件是整个目标反应的最佳妥协。

结论

自动样品制备是一种非常强大的分析工具，它可以进行几种协同组合，可以在分析工作流程的不同阶段提供非常高的性能。样品制备和方法开发是必不可少的，但极具挑战性的分析方面，可以显著受益于自动化的使用。事实上，自动化的吸引力并不仅仅在于非常好的方法鲁棒性和批对批的再现性。在液体处理中极其精确的流量控制和精确控制时间的能力(例如，衍生化目的的培养时间)打开了可被视为“高性能”样品制备的大门。方便、控制和一致性使连字符的自动样品制备成为任何系统超组的缺失连字符。

参考文献

1.分析化学，1980,52,297A−312A
2.Wilson I.D.等人，J.色罗姆。材料科学与工程，2003,29 (1):1- 6
3.海沃德等人。实验室。浙江农业学报，2016,48(7):14-17。