高通量LC-MS所需的关键UHPLC特征

LC-MS具有高灵敏度和选择性，是定量分析的主力技术。质谱(MS)检测允许同时识别和定量分析多种化合物，即使色谱分离不完善。这种能力极大地提高了多组分分析的吞吐量。在超高速UHPLC-MS方法中，分析周期时间是最关键的考虑因素。新一代UHPLC色谱柱填充亚2微米或表面多孔颗粒，效率高，允许更短的柱长和更快的分析。然而，仅仅通过使用最短的列是无法实现超高吞吐量的。首先，需要快速的注射速度和高的样品容量。其次，系统必须减少其他耗时因素，如漂洗时间。如果目标化合物有很强的倾向于吸附到系统的内表面，LC仪器必须在每次注射后仔细冲洗，以避免导致定量误差的残留。这个漂洗阶段可以大大增加分析周期时间。 And in addition, ‘non-data-acquisition time’, for column rinsing and system equilibration, has to be considered.

本文介绍了高通量LC-MS分析所需的关键前端UHPLC能力。

1.注射速度和样品容量

注射速度在实现高样品通量方面起着关键作用，因为注射序列的持续时间(=自动进样器注射样品所需的时间-不包括注射后冲洗)增加了分析周期时间。如果在30秒的梯度运行中注入一个样本需要30秒，那么分析周期时间的一半是“非数据采集时间”。这不利于实现高吞吐量目标。新一代UHPLC设备，如Nexera系列Sil-40自动进样器提供高速注射，注射周期时间仅6.7秒，不妨碍快速分析。
通过LC-MS/MS[1]对血浆中的药物进行高速分析是一个应用实例，它突出了使用超快速注射序列进行样品分析的有效性。血浆样品加标维拉帕米及其同位素标记类似物，使用5 x 2.1 mm UHPLC柱进行18秒等距分析。图1显示了该分析的代表性色谱图。

样品容量在实现高通量分析方面也发挥着关键作用，因为它允许延长无人值守操作的时间。向运行系统中添加样品的便捷性是高通量设备的另一个重要特征。开放存取设计允许在不中断正在进行的分析的情况下将样品添加到分析序列中。

2.携带和冲洗能力

LC-MS/MS系统具有超高的灵敏度，可以检测残留在系统中的痕量分析物，并在后续运行中洗脱。这种所谓的“结转”会对分析产生负面影响，并可能导致定量错误。在通量方面，这也是一个严重的问题，因为它需要在分析序列中增加漂洗阶段，导致更长的周期时间。自动进样器和分离柱是最可能的结转来源。在方法开发过程中最好处理基于列的结转-确保流动相/梯度条件足以除去任何痕量的分析物。对于自动进样器中残留的样品，有两种方法可以最大限度地降低系统结转的风险——进样器设计和有效的对策。
在“针入流道”设计中，样品被吸入针中，总体积直接扫入系统。因此，样品回路是流道的一部分，因此不断地用方法梯度冲洗，有助于减少化学吸附。这种设计消除了中间步骤，即加载一个单独的样品回路和所需的阀门开口和关闭，这可能会捕获样品并导致结转。全注法快速干净，是高通量LC-MS[2]的先决条件。
然而，并不是所有分子都允许跳过样品注射后的清理，他们需要额外的方法从系统中去除任何剩余的化合物。典型的问题是注射口和自动采样针。冲洗针头是最有效的解决方案之一，以冲洗任何剩余的分析物在其表面。大多数较新的自动采样器具有漂洗功能，允许将针浸入洗涤液中。但重要的是要注意，不仅是针的外表面，而且针的内表面都有被吸附的风险。此外，如果针头不完全清洁，注射口内壁也可能被污染。化合物可能积聚在这些部位周围，成为结转的来源。
克服这个问题需要一个精心设计的洗涤程序。各种漂洗方法和多种漂洗溶剂来清洗针的内外、样品环以及注射口的内部和表面，有助于解决目标化合物的广泛化学性质。人们可以设计一种洗涤程序，以消除任何残留-强有机洗涤，酸性或碱性洗涤，离子洗涤-任何需要的化合物的问题。图2强调了与外部冲洗相比，额外的针和注射口内部冲洗减少了结转。
当然，任何清洗/漂洗程序都会增加总自动采样序列的时间。这可能对分析序列时间有影响。

3.最大化吞吐量与多路配置

RPLC梯度分析需要执行各种过程，如针冲洗，柱清洗和重新平衡，为下一次样品注入做准备。虽然这些是生成有意义数据的基本过程，但它们会导致额外的“非数据采集时间”，从而影响吞吐量。减少MS闲置的时间，等待LC清洗和重新设置，可以显著提高吞吐量，并导致更高的实验室生产力。因此，通过在两个流之间切换到一个LC-MS，可以重叠数据采集时间和洗涤/平衡阶段的前端配置是一个系统中接近两倍样品吞吐量的理想解决方案。图3[3]显示了一个例子，该双流技术用于分析细胞色素P450家族中四个主要分子物种的四个生物标志物。与传统的单流方法1分22秒相比，只需38秒即可完成分析，每个样品节省44秒。

结论

LC-MS/MS是一种强大的定量分析技术，因为它提供了高选择性和灵敏的检测。对于实验室来说，要实现和保持高样品吞吐量，并从每个样品中获得尽可能多的信息，必须仔细考虑前端UHPLC系统的特性。当然，在先进的UHPLC前端配置中，样品注射速度和容量，自动进样器减少结转的能力，同时保持高速注射周期，以及执行多重分析的可能性都应该被考虑在内，以实现高效率和最大的样品吞吐量。

参考文献

1.T. Uchikata, D. Vecchietti，用SIL-40自动进样器对生物液体中的药物进行超快速分析-分析智能第5部分，岛津技术报告(C190-E228)
2.K. Watanabe, C. Campbell等人，Shimadzu UHPLC用于LC/MS分析的显著特征，Shimadzu技术报告(C190-E282)
3.Nexera MX手册(C190-E190)，岛津株式会社，2020年