用多模态色谱法优化病毒载体纯化策略

到2027年，全球疫苗市场预计将超过850亿美元，年增长率为9%。与此同时，全球基因治疗市场预计将超过50亿美元，年增长率约为34%。病毒制剂作为核酸传递载体或疫苗的成功使用是这些快速发展的生物医学部门的最重要的贡献之一。随着基于病毒的产品的多样性和临床应用的持续增长，下游加工过程中的挑战也在不断增加。考虑到临床应用、生产可扩展性和固有的病毒特性，色谱可以用于简化下游流程，从而帮助满足当前的需求。

下游病毒纯化的挑战

病毒被用于从基因治疗到疫苗开发和癌症治疗的众多临床应用。当代的病毒粒子纯化下游工艺大多改编自最初开发的重组蛋白和生物制剂的纯化方案，如单克隆抗体(mAbs)。与蛋白质分离类似，病毒纯化的下游过程也必须确保病毒的基本方面，如活性和稳定性在整个生产过程中保持完整[3]。然而，病毒颗粒复杂的生物物理特性带来了一些严重的挑战，传统的蛋白质纯化协议无法有效解决。与单个蛋白质不同，病毒颗粒要大得多，由多种蛋白质以独特的三维结构排列而成的复杂基质组成，这种结构被称为衣壳。此外，它们容易受到流体剪切应力条件、非生理pH值、表面活性剂和界面应力的损伤(图1)。病毒样颗粒、逆转录病毒和慢病毒等包膜病毒颗粒特别容易受到损伤，并具有额外的表面特征(如脂质双分子层)和/或发生了翻译后表面修饰(如糖基化)，这可能进一步复杂化下游过程[4]。
在确定采用哪种净化方法时，还应考虑上游工艺产生的典型细胞培养杂质。例如，腺病毒和腺相关病毒(AAV)是一些研究最广泛的载体，它们是从裂解细胞培养物中获得的。
这不可避免地将细胞碎片和其他杂质引入病毒制剂中，在产品分离之前需要清除这些杂质，如宿主细胞DNA和蛋白质、内毒素、外来病毒污染物和病毒-DNA聚集物[5]，这可能损害安全性和有效性。上游过程还可能导致产生缺乏治疗有效载荷或活性的受损或空病毒颗粒，以及封装错误遗传物质的病毒。下游净化过程必须根据特定产品的需要进行调整，同时考虑到上游病毒生产和收集方法所产生的特定病毒和杂质的特性。
传统上，下游病毒纯化方案通常涉及如密度梯度超离心等费力的步骤——虽然足以进行原理证明实验，但此类技术可能难以规模化，可能无法满足治疗产品[6]的严格纯度标准。因此，生物制药行业正在下游工艺中利用色谱技术的能力，以帮助满足大规模病毒纯化的需求，并实现较高的病毒回收率[5,6]。

利用色谱法扩大下游工艺

通常，蛋白质纯化的下游过程包括最初的蛋白质捕获步骤，对单克隆抗体来说，这包括使用蛋白A树脂的亲和层析(AC)，然后是考虑到感兴趣蛋白质的物理化学性质的两个抛光步骤，并有助于在产品分离之前去除任何残留的杂质。镜像蛋白质纯化方法，可以通过结合基于固定(树脂)和流动(溶质)相之间不同相互作用模式的步骤来获得最佳的病毒纯化——例如，一个步骤基于病毒粒子电荷，另一个步骤基于其疏水性。
通过利用病毒表面蛋白基序与特定细胞配体结合的能力，AC可应用于下游病毒纯化过程，从而帮助分离感兴趣的病毒颗粒。这种方法的一个显著局限性是，用于最初捕获AC的配体是针对现有的血清型的，这导致每次出现新的病毒血清型或平台时都要进行耗时的配体设计——这使得这种方法不适合大规模的病毒载体和疫苗生产[3]。

离子交换色谱法

离子交换色谱法(IEX)是AC的一种有效替代方法，通常用于整个生物制药行业的初始大规模病毒捕获[4,5,6]。离子交换器利用感兴趣的病毒粒子和溶液中存在的其他生物分子之间的净表面电荷的差异。例如，核酸由于骨干结构中电离磷酸基的存在总是带负电荷，而病毒净电荷取决于特定pH值[5]下表面带电氨基酸的比例。

在带负电荷的逆转录病毒和腺病毒的情况下，对原料进行核酸酶处理，然后使用阴离子交换色谱(AEX)树脂进行单步色谱(例如Nuvia HP-Q)已被证明是一种有效的大规模捕获步骤，非常适合生产临床级病毒载体[4,9]。与阳离子交换剂不同，阴离子交换剂通常在pH值和离子强度(盐浓度)条件下结合病毒，与上游生物反应器饲料流一致，从而提高过程的经济性和效率。AEX还可以作为抛光步骤，根据细微的电荷差异帮助分离空的和满的病毒衣壳，并从原料中去除带负电荷的杂质[8,9]。阳离子交换色谱(CEX)树脂(如Nuvia S)可用于捕获病毒，也常用于抛光步骤，以成功去除大部分工艺和产品相关的杂质[5,10]。
考虑到病毒颗粒的完整性容易受到环境波动的影响，包括pH值的变化、不同的缓冲液成分、温度的变化和剪切应力，设计一个下游处理平台至关重要，该平台能够以最少的步骤达到最高水平的纯度，以最大化的质量、效率和安全性。

用多模态色谱法提高下游工艺效率

多模式(或混合模式)色谱法的出现带来了高选择性介质的出现，旨在简化纯化过程，减少下游处理时间，提高整个过程的经济性。混合模式树脂将至少具有两种相互作用模式的配体组合在一起，如亲和性、尺寸排斥、离子交换和疏水相互作用。多模态色谱可以对病毒颗粒进行最佳的纯化，而用顺序单模方法则无法有效纯化病毒颗粒。
例如，在单一的疏水阳离子交换树脂中结合疏水相互作用和阳离子交换的特性，可以优化重组腺病毒[7]的捕获。具体来说，疏水阳离子交换树脂(如Nuvia cPrime)被用于捕获步骤，因为它能最好地清除带负电荷的饲料流污染物(如动物血清)，并导致处理体积减少10倍。然后，从该树脂洗脱液可以加载到第二个和最后一个阴离子交换柱(例如，Nuvia Q)，这导致额外的两倍的产品体积减少和优化的产品纯度可与临床级产品[7]媲美。利用多种相互作用模式，这种两步方法以更经济和时间有效的方式增强了病毒颗粒与杂质的分离。
类似地，羟基磷灰石色谱(HAC)混合模式介质，具有结合广泛的病毒颗粒的能力，可以有效地用于中间或最终抛光。HAC的混合模式能力可以基于钙亲和和阳离子交换相互作用分离分子。单步HAC已成功地用于从杂质中分离包膜(如登革病毒、日本脑炎病毒、流感病毒和小鼠肝炎病毒)和非包膜(如腺病毒、猫杯状病毒和脊髓灰质炎病毒)哺乳动物病毒，从而浓缩制备出高活性病毒[11,12]。

结论

随着病毒载体在基因治疗和疫苗开发中的应用持续增长，对更快产品开发和生产的需求也在不断增长。病毒颗粒理化性质的复杂性带来了独特的净化挑战，特别是在大规模生产环境中。色谱法已经成为一种高选择性且稳健可扩展的病毒纯化方法——具体来说，混合模式介质创新可以成为更快、更划算的产品开发和制造背后的驱动力。与单模色谱树脂不同，混合模式树脂允许(i)有效分离使用其他色谱方法看起来均匀的分子，(ii)选择性的单步去除杂质，(iii)建立最佳的结合和洗脱条件，因为有较大的设计空间，(iv)最小的原料处理，因为有强大的耐盐性，和(v)大容量高滴度的进料流[13]。
在下游纯化过程中应用多模态色谱法可以显著改进这种治疗方式的制造过程，以帮助满足对安全和有效的基因疗法和病毒载体疫苗日益增长的需求。

参考文献

1.全球疫苗市场，https://www.researchandmarkets.com/reports/5576812/global-vaccine-market-size-global-forecast-2022
2.基因治疗市场，https://brandessenceresearch.com/healthcare/gene-therapy-market-global
3.Nestola P et al(2015)改进了疫苗和基因治疗的病毒纯化工艺。生物技术和生物工程。
4.一种临床期逆转录病毒样颗粒的低成本、快速和可扩展的下游净化工艺开发，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_7200.pdf
5.Singh等人(2022)基因治疗病毒载体下游纯化的挑战。化学工程的当前观点。
6.Merten等人(2014)病毒载体的制造:第二部分。下游加工和安全方面。医药生物工艺。
7.Fitchmun M等人，腺病毒高效制造工艺的发展，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_6719.pdf
8.Joshi PRH等人(2021)开发了一种可扩展和健壮的AEX方法，用于在血清型5、6、8和9的含基因组VCs中富集rAAV制剂。分子疗法。方法与临床发展。21.341 - 356。
9.快速净化策略- H1N1净化，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_7375.pdf
10.Nuvia™S介质-用于生物分子纯化和下游处理的高容量阳离子交换器，https://www.bioradiations.com/nuvia-s-media-a-high-capacity-cation-exchanger-for-biomolecule-purification-and-downstream-processing/
11.Kurosawa等，利用陶瓷羟基磷灰石纯化哺乳动物病毒，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6549.pdf
12.Kurosawa等，混合模式CHT陶瓷羟基磷灰石XT介质单步纯化流感病毒和登革病毒，https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/psd/literature/Bulletin_7115.pdf
13.Scott C(2020)生物制药的混合模式色谱纯化，BioProcess International电子书，https://bioprocessintl.com/sponsored-content/mixed-mode-chromatography-resins-for-purification-of-biopharmaceuticals/