时间分辨电子显微镜的进步如何提高成像的生物样品吗?在罗莎琳德富兰克林研究所发现的边缘

扫描透射电子显微镜(STEM)一直是不可或缺的技术理解的结构材料在物理和生命科学。在过去的十年中,干细胞技术先进几乎分别研究无机生物材料;然而,新方法为研究生命从这些领域之间的重叠。一个这样的技术进步是使用电子高分辨率成像。

职责的改变生命科学通过跨学科研究和技术开发,罗莎琳德富兰克林研究所哈维尔校园在牛津郡是驾驶研究重叠,具有开创性的茎仪器成像生物材料的构思和发达国家通过其关联成像的主题。
Ruska是第一个三个工具被开发的富兰克林,独特的设计提供前所未有的空间和时间分辨率成像的低温冷冻生物材料和生物液体样品。
罗莎琳德富兰克林研究所的相关成像小组检查安装。陈黄博士教授博士Emanuela Liberti安格斯·柯克兰(左到右)。图片来源:瑞安·考恩。

脉冲照明为前所未有的时间和空间分辨率

结构损伤的生物标本是目前限制了空间和时间分辨率的主要因素阻止[1]。电子损伤生物物质根据能量转移到样品在辐照(即电子剂量)。损伤发生主要的电子能量的函数,的加速电压的显微镜。Ruska可以运行在一个广泛的加速电压,从300千伏到40 kV,允许最大的灵活性的选择原电子能量。
显微镜也可变脉冲照明。电子源,快速梁空格(或静电剂调制器)分发电子在样品可调的脉冲持续时间从µs女士电子的数量在每个脉冲也可调,允许剂量的精确控制。这种能力调节照明改善空间和时间分辨率,因为样本成像在短时间而损害控制[2]。脉冲照明特别好处成像在液体中减小损失是必要的,以避免beam-driven动力学。
为子帧记录Ruska也有静电光学。这项技术迅速偏转光束在不同区域的高速摄影机可编程序列[3]。通过这种方式,记录过程只是部分相机的速度限制,提高时间分辨率可能成千上万的帧每秒。

图1所示。一个典型的double-corrected扫描透射电子显微镜。Ruska提高标准设计由于高速静电消除器,一个安装在电子枪和一个相机前(没有显示)。Ruska为传统的环形探测器干细胞成像(这里显示只有一个),但也为提高时间分辨率高速摄像机。环形探测器积分散射强度的环形范围散射角度而高速摄像机收集的散射角。

改善与相位检索电子ptychography方法

Ruska光学畸变校正是关键仪器的改进的空间分辨率为研究生物材料[4](图1)。尽管校正物理科学研究中常用的无机材料,他们在生物学的应用程序是有限的。在Ruska,硬件校正镜头畸变应用透射电镜(TEM)和扫描(茎)光学组件。在TEM模式中,图像校正提高了样品的聚焦物镜导致更好的在高空间频率信息传递。然而,低频的转移仍然贫穷,这意味着生物结构很难辨别在单独的图像。实现高对比度更难低温冷冻样品或液体,因为周围的基质,这也有类似的样本密度,进一步降低了图像质量。
提高分辨率的方法是利用aberration-correction结合相位检索成像技术。这些方法利用信息传递的变化与照明设置以提高对比度一系列空间频率。阶段检索方法都适用于TEM和干细胞模式。富兰克林应用干细胞阶段检索方法,最近开发的物理科学(即电子ptychography)图像生物分子(如frozen-hydrated轮状病毒双层纳米粒子)与改进的对比与低温电子显微镜[5]。更高质量的图像可以减少当前大量的粒子和数据集需要在单粒子三维重建实现原子分辨率。阶段检索方法也不是绑定到一个均匀的小颗粒,但可以描述更大地区(1µm2)的异构标本结果分布或交互。
干细胞阶段检索技术的一个收敛的电子探针扫描整个样本记录二维阵列的相干(干扰)电子衍射模式然后送入ptychographic迭代引擎(ePIE)恢复对象退出与电子束散射所引起的波函数(图2)。ePIE计算方法用于解决目标函数的相位显微镜通过逆计算(所谓的“阶段问题”)[6]。传输的空间频率带宽在这个阶段检索过程取决于调查的收敛角,可以调整获得强大的相衬(图2)。
探究矫正的好处在Ruska操作杆模式来自于大范围收敛角用于成像因为probe-forming系统的重点是改善。例如,对于beam-resistant样本,收敛sub-Angstrom大小的探测器提供横向原子分辨率,和sub-nanometre深度分辨率。然而,小探测器有一个极高的电子通量(超过一万倍要求)将完全破坏生物材料。富兰克林打算利用探究矫正高空间分辨率的成像生物材料使用稀疏扫描几何图形,设计以智能的方式分发电子通量。稀疏的扫描方法扫描位置之间的时间间隔不同时间和空间几何或随机序列已经被开发为成像在液体和无机材料可以提供新的成像方法在生物学[7]。为此,Ruska配备额外的随机扫描发生器。这项技术可以改变扫描线圈的扫描模式来设计智能二次抽样像素扫描。
图2。电子ptychography实验的原理的生物分子成像。随着电子探针扫描整个样本,直接探测器收集相干光束电子衍射模式(cbe)。这4 d干数据集送入电子Ptychographic迭代引擎(ePIE)复苏的复杂对象和探测功能。

快速直接电子检测最大的时间分辨率

快一起茫然的,关键技术,使Ruska时间分辨电子仪器快速直接检测。直接探测器已经彻底改变了电子显微镜在过去十年[8]。这些相机区别与传统的传感器是他们改进的记录速度和探测器量子效率(DQE)。这些增强功能转化为更好的信噪比,即使一些电子用于成像,对生活和材料科学有巨大的影响。一个例子是低温电子显微镜的分辨率革命”在蛋白质结构的成像现在可能在原子分辨率使用直接检测和单粒子平均[9]。直接电子探测器的出现也改变着我们的原位成像。这里记录的速度快速捕捉动态事件至关重要,而探测器效率是必要的,因为所需的低剂量减少电子束与媒体的互动。
直接探测器是一个至关重要的生物成像技术在高空间和时间分辨率。Ruska将配备三个直接电子探测器(图1中高速摄像机)。每一个相机在不同的加速电压和成像模式执行效果最佳。最重要的是,这些探测器记录帧率都非常高,每秒成千上万的图片。摄像机也可以同步到落料机和扫描发生器,以达到最大程度的控制电子通量,照明速度和记录时间。

液体电池技术

我们的最终目标是研究生物过程在本国环境实时发生[2]。这意味着成像现场必须跨越广泛的空间和时间分辨率。Ruska将实现从分子尺度的微尺度空间分辨率和时间分辨率从毫到微秒,同时保持样本在液体环境中。显微镜将主办一个新设计的液体电池座,陷阱的溶液样品之间电子透明膜,使氮化硅或石墨烯薄片,从真空环境保护标本的显微镜(图3)。这种技术将使广泛的生物系统的研究,包括药物的相互作用、聚合物组装和蛋白质动力学。此外,Ruska配备了一个新的双能量色散x射线探测器化学映射。此技术使原位化学数据的集合,扩大的功能生物显微镜分析光谱的液体。将液体细胞成像与高空间,时间和化学决议Ruska将允许访问的功能,以前隐藏的、快速动态事件4 d。更大的理解分子动力学的生命系统可以被视为一个基本构建块改善我们对所有生物/医学系统的理解。
图3。liquid-cell TEM持有者的示意图。LCTEM持有者可以容纳芯片制成的硅衬底和电子透明Si3Nx窗户,或石墨烯网格。在这两种技术,样品在溶液中被封装在显微镜和超高真空密封的列。
富兰克林资助通过英国研究和创新工程和物理科学研究委员会(EPSRC)。研究所是一个独立的组织由英国研究和创新,十个英国大学,和钻石光源,在哈维尔科学和创新校园中央枢纽。它欢迎询盘关于合作研究。
关于Ruska电子显微镜的更多信息请联系:emanuela.liberti@rfi.ac.uk

引用

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2。·德容:;胡本,l;Dunin-Borkowski;罗斯·m·弗朗西斯分辨率和像差校正液体细胞透射电子显微镜,自然审查材料2019 4 61 - 78。
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4所示。细川氏;泽田师傅,h;近藤,y;Takayanagi k;Suenaga, K。、开发透射电子显微镜的Cs和Cc校正。23-41显微镜2013、62 (1)。
5。周,l;歌,j .;金,j·s·;裴,x;黄,c;博伊斯,m;Mendonca l;克莱尔,d;Siebert, a; Allen, C. S.; Liberti, E.; Stuart, D.; Pan, X.; Nellist, P. D.; Zhang, P.; Kirkland, A. I.; Wang, P., Low-dose phase retrieval of biological specimens using cryo-electron ptychography. Nature Communications 2020, 11 2773.
6。a . m .处女;Rodenburg, j . M。,衍射成像的改进ptychographical阶段检索算法,Ultramicroscopy 2009 109 1256 - 1262。
7所示。终于,l;史蒂文斯,a;Liyu, a;褐变:D。,实现准确、快速稀疏采样的方法对低剂量原子分辨率干细胞成像,应用物理信2016,109年164102。
8。MacLaren i;麦格雷戈,t . a;艾伦,c . s .;柯克兰,我。扫描透射电子显微镜,Detectors-The正在进行革命,为什么这种重要的材料特性。应用物理信材料2020、8 110901人。
9。Kuhlbrandt, W。,该决议革命。科学2014 343 6178。